Summary and Critical Review
Analysis of copy number variants by three
detection algorithms and their association with
body size in horses
Julia Metzger1, Ute Philipp1, Maria Susana Lopes2, Artur da Camara Machado2, Michela Felicetti3,
Maurizio Silvestrelli3 and Ottmar Distl1*
Metzger et al. BMC Genomics 2013, 14:487
Summary
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan evaluasi komparatif standar CNV pada kuda menggunakan tiga program deteksi CNV atau variasi dengan menyalin nomor (CNV) yang berbeda dan untuk mengidentifikasi wilayah genomik yang berkaitan dengan ukuran tubuh kuda. Analisis ini dilakukan dengan menggunakan Illumina Equine SNP50 genotip BeadChip untuk 854 kuda. CNV yang terdeteksi oleh tiga algoritma yang berbeda yaitu CNVPartition, PennCNV dan QuantiSNP. Perbandingan analisis algoritma yang terdeteksi CNV berguna untuk meningkatkan spesifisitas CNV tetapi memiliki keterbatasan tertentu tergantung pada alat pendeteksiannya.
Keywords: Body size, Copy number variation
Metodelogi penelitian
Pengambilan sampel telah disetujui oleh Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Oldenburg, Jerman (nomor registrasi 509c-42.502- 01A60, 02A-07A-138 dan 482).
persiapan sampel. Sampel EDTA - darah 17 ras yang berbeda dikumpulkan termasuk 148 Arab , satu Anglo - Arab, dua Brandenburger , 514 Hanoverian , sembilan Holsteiner , 13 Oldenburg , 5 Trakehner , 35 Westphalia , 1 Selle Francais, salah satu Kuda Poni Jerman, 47 Lusitano , 48 Maremanno , 2 Przewalski , 12 Rhinelander kuda , 2 RMG -Jerman , 14 Thoroughbred dan 1 Zweibrücker . DNA konsentrasi sampel disesuaikan dengan 50 ng / ml menggunakan Nanodrop ND - 1000 ( Peqlab Bioteknologi , Erlangen , Jerman ) dan kontrol kualitas dilakukan dengan gel elektroforesis menggunakan 1 % gel agarosa ( peqGold Universal Agarose , Peqlab Biotechnologie , Erlangen , Jerman ) . Semua 854 hewan genotyped menggunakan Illumina kuda SNP50 BeadChip ( Illumina , San Diego, Amerika Serikat ) , termasuk 54.602 SNP.
analisis data. Analisis daerah autosomal untuk CNV dilakukan dalam tiga program yang berbeda . PennCNV dijalankan sesuai dengan kriteria standar ( Illumina ) [ 17 ] dengan menggunakan baris perintah detect_cnv.pl - hmm example.hmm - PFB horse909Tiere.pfb - minsnp 3 - lastchr 31 -test - tabout - Coord - conf - listfile list.txt -out penncnv1.txt dan setelah itu pemeriksaan jumlah kurang dari tiga dihilangkan. Kontrol kualitas dilakukan menggunakan standar pengecualian dari Log Ratio ( SD ( LRR ) ) > 0,3 dan GC-content menyebabkan fluktuasi intensitas sinyal (│ │ GCWF)> 0,02. Kemudian menggunakan QuantiSNP 2.0, sebuah program berdasarkan Bayes Tujuan Hidden Markov- Model (HMM) [24], untuk analisis CNV. Deteksi dilakukan dengan perintah: quantisnp2-outdir kuda-logfile 909Pferde-chr [1:31]-chrx 32 - beadstudio-file 909Pferde.txt. Setelah deteksi CNV minimal penyelidikan pada hitungan ketiga, ambang batas untuk Log Bayes Faktor kurang dari sepuluh. CNVPartition 3.1.6 dijalankan Kriteria standar termasuk ambang batas kepercayaan 35, homozigot ukuran wilayah minimal 1.000.000 a minimal penyelidikan hitungan 3 dan GcWaveAdjustLRR. GWAS untuk hasil deteksi CNV masing-masing individu program dan persimpangan PennCNV , QuantiSNP dan CNVPartition dilakukan dengan menggunakan Plink versi 1.07. dan SAS / Genetika , versi 9.3 dalam analisis sifat kuantitatif.
analisis ontology. Database untuk Anotasi, Visualisasi dan Penemuan Terpadu (DAVID) 6,7 digunakan untuk penjelasan fungsional gen di daerah CNV [42,43]. Anotasi grafik fungsional dijalankan dengan ambang hitungan 2 dan koreksi Bonferoni ambang hitungan 0,1. Hasil dikelompokkan dalam kelompok-kelompok fungsional. Analisis ontologi Selanjutnya dilakukan dengan menggunakan PANTHER (Protein Melalui analisis Hubungan Evolusioner, versi 8,0) sistem klasifikasi untuk klasifikasi gen dengan fungsi molekul, proses biologis dan komponen seluler mengunakan standar Bonferoni koreksi [44].
qPCR validasi. Validasi tiga daerah genom yang berbeda untuk menyimpan CNV dilakukan dengan kuantitatif real-time ( QRT ) – PCR pada sistem, urutan detrksinya ABI7300 ( Terapan Biosystems oleh Life Technologies, Darmstadt , Jerman ). Kuantitatif real-time ( QRT ) – PCR dilakukan selama 10 menit ( min ) pada 95° C diikuti oleh 40 siklus pada 95° C selama 15 detik dan 60° C selama 1 menit. Analisis dilakukan untuk setiap dua kali sampel dan Nilai rata-rata digunakan untuk perhitungan lebih lanjut. Satu sampel tanpa variasi jumlah salinan dalam menganalisis daerah digunakan sebagai acuan . Untuk kuantifikasi relatif CNV menggunakan metode 2 - ΔΔCt [ 45 ] . Nilai-nilai ΔCT dari sampel uji dikurangi dari ΔCT dari sampel acuan dan dimasukkan ke dalam Formula 2 - ΔΔCt .
Hasil dan diskusi penelitian
Mendeteksi CNV
Pendeteksian CNV dilakukan pada data Illumina Equine SNP50 BeadChip menggunakan algoritma CNVPartition (Illumina), PennCNV [17] dan QuantiSNP [24]. Mengungkapkan bahwa dengan mengunakan program ini untuk mendeteksi 166, 860 dan 1090 CNV dengan cara menambahkan satu file, menambahkan dua file dan menambahkan 3 file, menghasilkan rata – rata ukuran untuk semua CNV yang terdeteksi adalah 487.562 bp dan median 169.367 bp. Namun, kromosom dengan jumlah tertinggi CNV tidak selalu menunjukkan cakupan tertinggi dengan Daerah CNV. Di temukan kuat cakupan pengayaan CNV pada ECA23 (CNVPartition), ECA13 (PennCNV), ECA27 dan ECA28 (PennCNV dan QuantiSNP) dan ECA12 .
Perbandingan antara tiga program. deteksi Analisis perbandingan antara algoritma menunjukkan bahwa PennCNV dan QuantiSNP terdeteksi pada nomor yang sama,CNV diidentifikasi pada setiap autosom. Semuanya ditampilkan CNV yang terdeteksi tumpang tindih dari 28,4% dan 22,8%. Persentase CNV yang tumpang tindih dengan CNVPartition, algoritma dengan jumlah terendah yang terdeteksi CNV, adalah 32,5% (PennCNV) dan 37,4% (QuantiSNP). Total, 50 CNV dapat dideteksi oleh ketiga program (File tambahan 4). Ukuran rata-rata dari 50 CNV terdeteksi oleh ketiga program adalah 388.892 bp dan berkisar dari 516 sampai 978.353 bp (ukuran rata-rata 293.244 bp). Analisis asosiasi dengan ukuran tubuh. GWAS untuk ukuran tubuh dilakukan untuk setiap algoritma atas dasar hasil pendeteksian oleh CNV dan untuk persimpangan dari ketiga program. Analisis persimpangan 50 CNV mengungkapkan nilai-P di ambang signifikansi ( P = 0,057 ) mungkin dipengaruhi oleh CNVPartition yang tidak ditemukan adanya hubungan yang signifikan. Sebuah wilayah CNV kedua, dengan asosiasi tertinggi untuk ukuran tubuh (P = 0,0002), terletak di ECA8 di 4,43- 4.62 Mb. Semua penghapusan heterozigot bisa ditemukan pada kuda berukuran lebih besar dan tidak ada dalam kuda yang lebih kecil.
Sebuah wilayah calon ketiga dapat dideteksi oleh QuantiSNP pada ECA9 ( P = 0,006 ) pada 29.89 Mb . CNV ini menunjukkan penghapusan warmblood untuk 37 kuda berukuran besar.
Asosiasi daerah CNV pada ECA1 dan ECA8 dapat dikonfirmasi oleh dua algoritma yang terdeteksi, sementara daerah puncak pada ECA9 secara eksklusif terdeteksi oleh QuantiSNP. Illumina algoritma CNVPartition tidak mengungkapkan adanya hubungan apapun untuk ukuran tubuh meskipun CNV terkait pada ECA1 dan ECA8 dapat dideteksi oleh ketiga program . Asumsinya jika rendahnya jumlah yang terdeteksi oleh CNV hanya beberapa kuda adalah untuk asosiasi di hilangkan. Untuk alasan ini mengusulkan CNVPartition yang tidak memungkinkan sesuai analisis asosiasi akibatnya tingkat negatif sangat tinggi. Hal ini berkorelasi dengan baik karena keakuratannya terdeteksi oleh masing-masing algoritma.
qPCR validasi. Untuk validasi terdeteksinya CNV dilakukan analisis qPCR dalam dua CNV pada ECA1 dan satu CNV pada ECA8 pada dua puluh kuda masing-masing (file tambahan 8). Ketiga wilayah CNV dapat dikonfirmasi oleh qPCR. Tingkat salinan akurat deteksi dengan jumlah satu algoritma adalah 95 % untuk Olfr1284 ( ENSECAG00000006791 ) pada ECA1 dan 80 % untuk IGLV3 - 32 ( ENSECAG00000005113 ) pada ECA8 . Untuk wilayah CNV pada ECA1 pada gen kandidat OR4K2 ( ENSECAG00000006318 ) semua kuda bisa divalidasi . Hasil menunjukkan bahwa CNV dianalisis dapat divalidasi meskipun beberapa kuda tidak menunjukkan jumlah salinan dideteksi dengan analisis Chip SNP .
Kesimpulan
Bahwa secara umum penciptaan persimpangan tiga CNV - program berguna untuk meningkatkan akurasi deteksi CNV dan untuk mengurangi jumlah hasil positif yang palsu. Namun demikian , perbandingan antara program-program ini juga menyediakan pembatasan yang kuat dan jumlah yang lebih tinggi maka hasilnya sangat tergantung pada pilihan deteksi alat. Analisis komparatif CNV ini berguna untuk pendekatan hasil penelitian karena mengungkapkan keterbatasan program dan membantu untuk memperkirakan keaslian dari hasil tersebut.
Critical Review
Cara Penulisan jurnal sebaiknya yang di tulis metode penelitiannya duhulu setelah itu baru hasil dan diskusi penelitian tersebut agar isinya tersusun rapi. Sehingga untuk pembaca yang awam tidak kebingungan. Meski begitu tetapi isinya sangat bagus dan menarik. Saya puas dengan jurnal ini karena saya dapat belajar banyak dan menambah pengetahuan. Dan untuk kedepannya diperbaharui lagi program CNV-nya untuk hasil yang lebih akurat.